Fenilcetonuria de diagnóstico precoz: Bases fisiopatológicas del daño neuronal y opciones terapéuticas / Early diagnosis of phenylketonuria. Physiopathology of the neuronal damage and therapeutic options

La fenilcetonuria, también conocida como PKU, es el error congénito más frecuente del metabolismo de los aminoácidos. La forma grave o PKU clásica no tratada, causa una discapacidad intelectual, aunque los programas de detección en el período neonatal, el diagnóstico y el tratamiento evitan la aparición de los síntomas. A pesar de un diagnóstico y tratamiento temprano hemos observado cierta neurotoxicidad en los pacientes con PKU tratados. Analizamos los demás factores implicados, aparte de la toxicidad por las elevadas concentraciones cerebrales de fenilalanina (Phe), se revisan los defectos de síntesis de neurotransmisores, las alteración de la mielinización cerebral, el efecto de la elevación de Phe en los procesos de transporte y distribución de los aminoácidos neutros con una síntesis anómala de proteínas cerebrales, la deficiencia plasmática y cerebral de tirosina, la neurotoxicidad de los metabolitos de Phe, el defecto de la biosíntesis del colesterol o el aumento del estrés oxidativo. Las alteraciones de la sustancia blanca en los pacientes con PKU tienen un papel importante en las manifestaciones neurológicas. El tratamiento de la PKU es para toda la vida y se basa en la reducción del aporte de alimentos que contienen Phe combinado con la administración de una fórmula especial, o en el tratamiento con tetrahidrobiopterina (BH4). Se analizan nuevas opciones terapéuticas.

Phenylketonuria, also known as PKU, is the most frequent congenital inborn error of metabolism. The severe form or classic PKU untreated causes intellectual disability, although with the early detection programs in the neonatal period, diagnosis and treatment prevent the appearance of the symptoms. Despite early diagnosis and treatment we have observed some neurotoxicity in treated PKU patients. We analyzed the factors involved apart from the toxicity due to the high cerebral concentrations of phenylalanine (Phe), the defects of synthesis of neurotransmitters, the alteration of cerebral myelination, the effect of the elevation of Phe in the processes of transport and distribution of neutral amino acids with an abnormal synthesis of brain proteins, plasma and cerebral tyrosine deficiency, the neurotoxicity of Phe metabolites, the defect of cholesterol biosynthesis or the increase of oxidative stress. White matter alterations in early treated PKU patients have an important role in neurological manifestations. The treatment of PKU is for life and is based on the reduction of foods containing Phe combined with the administration of a special formula or tetrahydrobiopterin (BH4) treatment. New therapeutic options will be analyzed.

Relationship between Tetrahydrobiopterin and Portal Hypertension in Patients with Chronic Liver Disease

Tetrahydrobiopterin (BH4) is an essential cofactor in NO synthesis by endothelial nitric oxide synthase (eNOS) enzymes. It has been previously suggested that reduced intrahepatic BH4 results in a decrease in intrahepatic NO and contributes to increased hepatic vascular resistance and portal pressure in animal models of cirrhosis. The main aim of the present study was to evaluate the relationship between BH4 and portal hypertension (PHT). One hundred ninety-three consecutive patients with chronic liver disease were included in the study. Liver biopsy, measurement of BH4 and hepatic venous pressure gradient (HVPG) were performed. Hepatic fibrosis was classified using the Laennec fibrosis scoring system. BH4 levels were determined in homogenized liver tissues of patients using a high performance liquid chromatography (HPLC) system. Statistical analysis was performed to evaluate the relationship between BH4 and HVPG, grade of hepatic fibrosis, clinical stage of cirrhosis, Child-Pugh class. A positive relationship between HVPG and hepatic fibrosis grade, clinical stage of cirrhosis and Child-Pugh class was observed. However, the BH4 level showed no significant correlation with HVPG or clinical features of cirrhosis. BH4 concentration in liver tissue has little relation to the severity of portal hypertension in patients with chronic liver disease.

Sapropterina no tratamento da hiperfenilalaninemia com deficiência de BH4 / Sapropterin in the treatment of hyperphenylalaninemia with BH4 deficiency

Fenilcetonúria (FNC) é uma doença genética, autossômica recessiva, causada por mutações no gene localizado no cromossomo 12q22-q24, o qual codifica a enzima hepática fenilalanina-hidroxilase (FAH). Sua ausência ou deficiência impede a conversão hepática de fenilalanina (FAL), um dos aminoácidos essenciais e mais comuns do organismo, em tirosina, causando acúmulo de FAL no sangue e em outros tecidos. O aumento de fenilalanina no sangue em 98% dos casos é devido a mutações na codificação genética para a enzima fenilalanina-hidroxilase, enquanto 2% são devidos a defeitos no metabolismo da tetrahidrobiopterina (BH4), que é um cofator essencial para a atividade da fenilalanina-hidroxilase. A principal característica da doença não tratada é retardo mental, com piora durante a fase de desenvolvimento do cérebro e que se estabilizaria com a maturação completa deste órgão. O quociente de inteligência (QI) mede a extensão deste retardo e varia de leve a gravemente prejudicado. A HFA não tratada resulta em progressivo retardo mental, com QI < 50. A piora está relacionada aos níveis sanguíneos de FAL. Caso a doença seja diagnosticada logo após o nascimento e o paciente for mantido em dieta restrita em FAL, os sintomas podem ser prevenidos e a criança pode ter desenvolvimento e expectativa de vidas normais. Nesse sentido, o rastreamento no Brasil é realizado pelo teste do pezinho, cuja necessidade consta no Estatuto da Criança e do Adolescente, e está regulamentado pela portaria que estabeleceu o Programa Nacional de Triagem Neonatal para diagnóstico precoce de fenilcetonúria. No Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas do Ministério da Saúde para Fenilcetonúria foram incluídos os pacientes com níveis de FAL≥ 10mg/dl (600 µmol/l) em dieta normal 1,14 e todos os que apresentarem níveis de FAL entre 8 e 10 mg/dl persistentes (pelo menos em 3 dosagens consecutivas, semanais, em dieta normal). Dieta restrita em FAL é eficaz em reduzir os níveis sanguíneos de FAL e melhorar o QI e o prognóstico neuropsicológico dos pacientes com HFA. O tratamento deve ser iniciado tão cedo quanto possível, idealmente até o 10º dia de vida. O aleitamento materno deve ser encorajado e associado ao uso de fórmula isenta de FAL. Os níveis de FAL devem ser diminuídos rapidamente. Além da dieta, o tratamento clínico recomendado pelo PCDT do Ministério da Saúde para o controle metabólico dos pacientes é a utilização de fórmulas alimentares especiais. As fórmulas são medicamentos que devem conter as quantidades recomendadas de vitaminas e sais minerais adequadas à faixa etária do paciente. Sapropterina é uma forma sintética oral de BH4 (BH4 supplementation sapropterin dihydrochloride). Há relatos de casos de pessoas com FCN que apresentaram boa resposta após o uso de doses farmacológicas de BH4, com redução dos níveis de FAL. Todos tinham mutação no gene FAH. Pessoas com resposta ao BH4 são identificadas inicialmente por um teste com teste de tolerância a BH4. Resposta positiva é considerada como uma redução de 30% ou mais na concentração de FAL, 24 horas após a administração de BH4. A variação na intensidade da resposta é independente da gravidade da FCN, da dose de BH4 empregada no teste de tolerância, duração do teste e genótipo. Pessoas com mesmo genótipo mostram respostas diferentes. Há poucos resultados de uso de longa duração de BH4 que mostram que pode haver relaxamento da restrição dietética sem efeitos adversos. A maioria dos indivíduos dos estudos apresentava doença moderada ou leve. A Secretaria-Executiva da CONITEC realizou busca na literatura por artigos científicos, com o objetivo de localizar a melhor evidência científica disponível sobre o tema. A CONITEC em sua 14ª reunião ordinária realizada no dia 04 de abril de 2013, recomendou a não incorporação no SUS da sapropterina para o tratamento de hiperfenilalaninemia (HFA) com deficiência em tetrahidrobiopterina (BH4). Considerou-se que os estudos, a maioria de baixa qualidade metodológica, não conseguiram comprovar a superioridade do tratamento, principalmente no que diz respeito à ausência de dados específicos para o subgrupo com deficiência de BH4. Os membros da CONITEC presentes na 15ª reunião do plenário do dia 09/05/2013 deliberaram, por unanimidade, por não recomendar a sapropterina para o tratamento de hiperfenilalaninemia (HFA) com deficiência em tetrahidrobiopterina (BH4). A Portaria nº 34, de 6 de agosto de 2013 - Torna pública a decisão de não incorporar o medicamento sapropterina no tratamento da hiperfenilalaninemia com deficiência de BH4 no Sistema Único de Saúde (SUS).

Responsividade à tetrahidrobiopterina em pacientes com deficiência de fenilalanina hidroxilase / Tetrahydrobiopterin responsiveness of patients with phenylalanine hydroxylase deficiency

OBJETIVO: Identificar indivíduos responsivos à tetrahibrobiopterina (BH4) em uma amostra de pacientes brasileiros com hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina-hidroxilase (HPA-PAH). MÉTODOS: Estudo intervencional, amostragem por conveniência. Para serem incluídos no estudo, os pacientes deveriam: possuir diagnóstico bioquímico de HPA-PAH; ter idade > 7 anos; estar em tratamento dietético; e apresentar níveis de fenilalanina (Phe) > 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. Os níveis de Phe foram determinados por meio de espectrometria de massas in tandem no dia anterior (dia 1) e nos pontos de hora 0, 4 e 8 h (dia 2) e 24 h (dia 3) após ingestão de BH4. Os critérios utilizados para definir responsividade ao BH4 foram: critério 1-redução > 30 por cento de Phe após 8 h da administração de BH4; e critério 2-redução > 30 por cento de Phe após 24 h da administração. RESULTADOS: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo (mediana de idade = 14 anos, sexo masculino = 12). Cinco pacientes foram responsivos ao BH4, sendo três (forma clássica: um; forma leve: dois) de acordo com ambos os critérios, e dois (forma clássica: um; forma não definida: um) de acordo com o critério 2. Os níveis de Phe plasmáticos do dia 1 não demonstraram variação nos pontos de hora (p = 0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora dos dias 1 e 2, encontramos uma variação significativa (p = 0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo confirmou o caráter multifatorial da responsividade ao BH4. CONCLUSÃO: Os nossos achados estão de acordo com a literatura e indicam que um número relevante de pacientes brasileiros com HPA-PAH é responsivo à BH4.

OBJECTIVE: To identify patients responsive to tetrahydrobiopterin (BH4) in a sample of Brazilians with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH). METHODS: Interventional study, convenience sampling. The inclusion criteria were: diagnosis of HPA-PAH; age > 7 years; phenylalanine-restricted diet and phenylalanine (Phe) levels > 6 mg/dL in all blood tests 1 year before inclusion. Blood samples were obtained the day before (day 1) and at 0, 4, 8 (day 2) and 24 h (day 3) after BH4 intake. Phe levels were measured using tandem mass spectrometry. The criteria used to define responsiveness to BH4 were: criterion 1- Phe reduction > 30 percent 8 h after BH4 administration; criterion 2 - Phe reduction > 30 percent 24 h after BH4 administration. RESULTS: Eighteen patients were enrolled (median age, 14 years; 12 boys). Five patients were responsive to BH4, 3 according to both criteria (one classical PKU, two mild PKU); and two according to criterion 2 (one classical PKU; one indefinite PKU type). There were no differences between Phe serum levels on day 1 and at the other time points (p = 0.523). However, Phe levels on days 1 and 2 were significantly different (p = 0.006). The analysis of the phenotype-genotype association confirmed its multifactorial character. CONCLUSION: A relevant number of Brazilian patients with HPA-PAH are responsive to BH4, in agreement with other studies in the literature.

Insulin Enhances Nitric Oxide Production in Trabecular Meshwork Cells via De Novo Pathway for Tetrahydrobiopterin Synthesis

PURPOSE: To investigate the effect of insulin on the production of nitric oxide (NO) in the trabecular meshwork (TM) cells and the enzymatic synthetic pathway of tetrahydrobiopterin (BH4) synthesis. METHODS: Primarily cultured human TM cells were exposed to 1, 10, and 100 microgram/ml of insulin and 0, 1, 10, 100 and 1000 nM dexamethasone for 3 days. To evaluate the enzymatic pathway of BH4 synthesis, 10 micrometer dexamethasone, 5 mM diaminopyrimidinone, 100 micrometer ascorbic acid, 100 micrometer sepiapterin, or 10 micrometer methotrexate were also co-administered respectively. Cellular survival and NO production were measured with MTT and Griess assay. RESULTS: Insulin enhanced NO production in a dose-dependent manner significantly (p<0.05) without affecting cell viability, whereas dexamethasone inhibited NO production. With co-exposure of insulin, diaminopyrimidinone and sepiapterin inhibited insulin-induced NO production. Ascorbic acid increased NO production independent of insulin and methotrexate did not affect to the action of insulin in NO production. CONCLUSIONS: Insulin increases NO production in TM cells via de novo synthetic pathway for BH4 synthesis. Insulin could be involved in the regulation of trabecular outflow by enhancing NO production in TM cells.

Nitric oxide: a major determinant of mast cell phenotype and function

Mast cells (MC) are important in the numerous physiological processes of homeostasis and disease. Most notably, MC are critical effectors in the development and exacerbation of allergic disorders. Nitric oxide (NO) is a diatomic radical produced by nitric oxide synthase (NOS), and has pluripotent cell signaling and cytotoxic properties. NO can influence many MC functions. Recent evidence shows the source of this NO can be from the mast cell itself. Governing the production of this endogenous NO, through alterations in the expression of tetrahydrobiopterin (BH4), a NOS cofactor, has stabilizing effects on MC degranulation. Furthermore, NO regulates the synthesis and secretion of de novo generated mediators, including leukotrienes and chemokines. These novel observations add to the growing body of knowledge surrounding the role of NO in the MC.

Immune function in children with classical phenylketonuria and tetrahydrobiopterin deficiencies.

BACKGROUND: An increased susceptibility to infections has been observed in some patients with phenylketonuria (PKU), which is not well known whether it is due to alterations of plasma essential amino acid concentrations or to some other factors. OBJECTIVE: This study is designed to establish B cell and T cell functions in 44 children with classical PKU and tetrahydrobiopterin (BH4) deficiencies and the effects of too high plasma phenylalanine (PA) concentrations (16.53 to 30.54 mg/dL) on the same parameters. DESIGN: B and T cell functions of 33 children with classical PKU (divided into two groups based on fasting mean plasma PA concentrations: Group-I = 20.9 +/- 3.7 mg/dL, Group-II = 3.8 +/- 1.02 mg/dL), and 11 children with BH4 deficiencies (Group III) were studied. The results were compared between the groups and referenced with previously reported values from healthy controls. RESULT: Delayed type skin hypersensitivity responses to purified protein derivative (PPD) in Group I and phytohaemagglutinin (PHA) in Group I, III were lower than the other groups and healthy controls. Plasma IgG and IgM concentrations of Group I was lower than the reference values. Although mean serum zinc and iron levels of all patients were lower than published values of healthy children, zinc and iron deficiencies in Group I, III were much more prominent as compared to Group II. CONCLUSION: The somewhat low plasma IgG concentrations in Group I may be related to the very high plasma PA levels, however the role of zinc deficiency as a causal factor can not be ruled out. BH4 metabolism defects do not appear to affect the same parameters. Impaired delayed skin hypersensitivity responses in Group I and III can be explained by severe serum zinc deficiency. In the light of this study, we conclude that in order to establish a causal relationship between PKU and immune functions, further studies need to be conducted after the correction of micro-nutrient status of such children.

Phenylketonuria detected by the neonatal screening program in Thailand.

Neonatal screening for phenylketonuria (PKU) was introduced as a pilot project in Thailand from 1992--1995, and mass screening was started in 1996 by the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health. Blood samples were collected by heelprick on filter paper either at 48 hours of life or before discharge from the hospital. Elevated blood phenylalanine was identified by screening with the Guthrie method, then followed by the fluorometric method: All infants with a phenylalanine level equal to or greater than 4 mg/dl were recalled and retested using the fluorometric method and confirmed by plasma amino acid analysis and urinary pterins for tetrahydrobiopterin deficiency. A total of 1,062,676 newborns were screened from October 1992--March 2001, with 5 cases confirmed with PKU. The incidence was 1 in 212,535. All patients have been treated with low phenylalanine diet. The results of this study confirm the benefit of early detection and treatment of PKU through the screening program.

Successful therapy of hyperphenylalaninemia due to defective tetrahydrobiopterin metabolism in two siblings

Alguns pacientes com o diagnóstico inicial de fenilcetonúria (PKU) näo apresentam melhora clínica mesmo apesar de tratados com uma dieta pobre em fenilalanina. Inúmeros trabalhos publicados nos últimos dez anos têm atribuído esses casos a erros no metabolismo da tetra hidrobiopterina (BH4), um cofator essencial para a hidroxilaçäo de fenilalanina, tirosina e triptofânio. Descrevem-se duas irmäs que apresentam um defeito na síntese de BH4, nas quais a administraçäo oral de BH4, L-Dopa, Carbidopa e 5-hidróxi-triptofânio foi seguida de significativa melhora clínica, neurofisiológica e bioquímica. Dados obtidos na nossa regiäo permitem supor que a freqüência de defeitos no metabolismo do BH4, entre os pacientes com hiperfenilalaninemia seja maior que a presentemente estimada. Ao contrário dos indivíduos com PKU clássica, alguns pacientes com deficiência de BH4 parecem responder ao tratamento mesmo quando este é introduzido tardiamente. Enfatiza-se a importância de aplicar o teste para o diagnóstico de deficiência de BH4 em todos os pacientes com hiperfenilalaninemia

Heterozygote detection in two hyperphenylaninemia types: classic phenylketonuria and dihydrobiopterin biosynthesis deficiency

Controles normais (N=41) e heterozigotos comprovados para dois tipos de hiperfenilalaninemia (HP), fenilcetonúria clássica (HP I, N=8) e deficiência de síntese de dihidrobiopterina (HP V, N = 6), foram estudados quanto aos níveis séricos de fenilalanina (P) e tirosina (T), medidos por fluorometria. Foram observados os seguintes valores para P e T, respectivamente: controles, 79,4 + ou - 15,8 e 86,6 + ou - 19,0; HP I, 158,5 + ou - 18,8 e 96,7 + ou - 25,7; HP V, 148,3 + ou - 28,8 e 85,5 + ou - 27,7. A relaçäo p2/T e a funçäo discriminante usando simultaneamente P e T foram os parâmetros que melhor distinguiram controles dos dois tipos de heterozigotos. Näo foi possível separar heterozigotos para HP I daqueles para HP V por nenhum desses parâmetros